Prezbiterium kościoła jest zamknięte prostą ścianą i sklepione kolebkowo z gurtami. Dekoracja prezbiterium prezentuje wiernym zapowiedź nadejścia Chrystusa. Ołtarz główny, ufundowany pod koniec XVII wieku przez ks. Krzysztofa Sowińskiego, zaprojektował Fontana a wykonali kamieniarze krakowscy. Obraz w centralnym polu ołtarza został ufundowany przez mieszczkę krakowską. Jest to „Św. Anna Samotrzeć” - dzieło Jerzego Eleutera Siemiginowskiego. Ten polski malarz znany jest dziś głównie jako artysta nadworny Jana III Sobieskiego. Krakowska „Św. Anna Samotrzeć” jest jednym z niewielu jego obrazów o tematyce religijnej, które zachowały się do dziś. W czasie, gdy budową kolegiaty zarządzał ks. Piskorski, Siemiginowski na jego zlecenie wykonał również projekt konfesji św. Jana Kantego, który zrealizowany został przez Fontanę. Prawdopodobnie Siemiginowski był również twórcą projektu relikwiarza na głowę św. Jana Kantego, fundowanego przez grono profesorów Uniwersytetu i wykonanego przez krakowskiego złotnika, Jana Ceyplera.
Obraz w ołtarzu ujęty jest w ozdobną, złoconą ramę, a po jego bokach widzimy dwie pary masywnych, kręconych kolumn, oplecionych złotym łańcuchem splecionych liści, z figurami aniołów u dołu, a powyżej - rozbudowane zwieńczenie z rzeźbionymi aniołami oraz dużą, promienistą glorią podtrzymywaną przez putta, w której ukazana jest księga rodowodu Chrystusa. Przed ołtarzem ustawiono na postumentach wykonane ze stiuku posągi dwóch świętych patronów Polski: św. Wojciecha po prawej stronie i Stanisława biskupa — po lewej. Posągi wykonano w 1701 roku, tak samo jak ustawione przed ołtarzem nieduże, barokowe tabernakulum, dzieło stolarza Jana Baura. Na drzwiczkach tabernakulum zobaczyć możemy srebrną plakietkę z trybowaną sceną Chrystusa w Emaus — wykonał ją w 1702 roku Jan Ceypler.
W prezbiterium — tak jak w całej świątyni, dekoracja rzeźbiarska przenika się z malarską. W ścianie zamykającej prezbiterium, tuż nad glorią wieńczącą ołtarz znajduje się okno, zamknięte łukiem segmentowym, ujęte w dekoracyjne obramienie. Po bokach okna umieszczono płaskorzeźbioną, stiukową scenę Zwiastowania - po prawej stronie widzimy postać klęczącego Archanioła Gabriela, a po stronie lewej: Marię. Scenę Zwiastowania dopełnia popiersie Boga Ojca oraz gołębica, symbolizująca obecność Ducha Świętego — umieszczone w medalionie tuż nad oknem. Na dekoracyjnej attyce, w dolnych partiach gurtów rzeźbione anioły podtrzymują medaliony z postaciami świętych polskich: Jana Kantego, Jacka, Stanisława Kostki i Bł. Szymona z Lipnicy. Płaskorzeźby stiukowe pojawiają się również na sklepieniu prezbiterium: w pierwszym i w trzecim przęśle sklepienia, są to dwie sceny w stiukowych obramieniach: Boże Narodzenie oraz Duch Święty w glorii promienistej. W środkowym przęśle natomiast pojawia się malowidło, które przedstawia wiernym Najświętszą Pannę Marię Niepokalanie Poczętą. Malowidło wykonał Karol Dankwart w 1696 roku. Dankwart był szwedzkim artystą, działał na przełomie XVII i XVIII wieku. Jest autorem iluzjonistycznych fresków w wielu kościołach w Polsce, a do jednej z najważniejszych i najbardziej znanych realizacji należą malowidła w bazylice na Jasnej Górze.
Gurty dzielące sklepienie pokryte są dekoracją stiukową o motywach roślinnych, podobna dekoracja — stiukowe wieńce owoców i roślin, pojawia się też na krawędziach lunet sklepienia. W lunetach umieszczono sceny, które dopełniają program ikonograficzny prezbiterium — pierwszej i trzeciej lunecie widzimy malowidła a w szczytach stiukowe aniołki, podtrzymujące nieduże medaliony z postaciami polskich świętych: Stanisława biskupa, Wojciecha, Floriana i Kazimierza. Autorem malowideł również jest Dankwart, wykonane zostały w 1696 i prezentują postaci aniołów, które symbolizują: Devotio — poświęcenie, Adoratio — adoracja, Oblatko — ofiarowanie, Sanctificatio — uświęcanie. W środkowych lunetach zamiast malowideł umieszczono medaliony, na których ukazane są sceny Zwiastowania narodzin Marii św. Joachimowi oraz św. Annie.
Zarówno w prezbiterium, jak i w nawie głównej i transepcie, fryz belkowania na osi pilastrów dekorują rzeźbione ze stiuku główki aniołków ze wstęgami a między pilastrami — putta z kartuszami, na których widnieją imiona przodków Chrystusa.
Przy ścianach prezbiterium ustawione są późnobarokowe, dwurzędowe rzeźbione stalle. Wykonał je Jan Olbrosowicz w 1730 roku. W zapleckach umieszczone są cztery owalne obrazy, wykonane przez krakowskiego artystę Szymona Czechowicza. Widzimy na nich cztery sceny z życia św. Anny: Zwiastowanie Narodzin Marii, Spotkanie św. Anny ze św. Joachimem, Narodziny Marii oraz św. Anna ze św. Joachimem i małą Marią.
Przy wschodniej ścianie prezbiterium znajduje się prostokątna zakrystia, a przechodząc obok niej mijamy piękny barokowy portal - prostokątny, profilowany, z 1696, wykonany przez Jana Liszkowica.
Po drugiej stronie prezbiterium znajduje się skarbiec — do niego prowadzi portal wykonany przez Jakuba Krupczyńskiego, również jest to portal prostokątny, datowany na końcówkę XVII wieku w supraportach obydwu tych portali umieszczono epitafia dwóch doktorów teologii — z jednej strony jest to epitafium Krzysztofa Sowińskiego, a z drugiej — Pawła Wojewódzkiego.